Phân lập và xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh bại huyết trên vịt (Riemerella anatipestifer) tại huyện Nam Trực, tỉnh Nam Định

Bệnh do R.anatipestifer là một bệnh truyền nhiễm trên vịt, ngỗng, gà tây và nhiều loài gia cầm khác. Bệnh được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: bệnh bại huyết trên vịt, hội chứng anatipestifer, bệnh bại huyết do anatipestifer hay bệnh viêm thanh mạc truyền nhiễm (Soman & cs., 2014). Các dấu hiệu lâm sàng thường biểu hiện là ủ rũ, chảy nước mắt, nước mũi, ho, hắt hơi, vịt tiêu chảy phân màu xanh, đi đứng khó khăn, bơi chèo, quẹo cổ và run đầu. Một số con không có khả năng theo đàn, rối loạn vận động. Bệnh có thể gây chết vịt con từ 5 - 75% tùy theo điều kiện môi trường. Bệnh xảy ra thể cấp tính hoặc mãn tính với các bệnh tích đặc trưng như: viêm màng ngoài tim, viêm màng bao gan có fibrin, viêm túi khí và viêm màng não (Rubbenstroth & cs., 2011). Vi khuẩn mẫn cảm cao với doxycycline (96,8%), amoxycillin-clavulanic acid (93,2%) (Chen & cs., 2012); florfenicol (97,9%), ampicillin (95,1%) (Gyuris & cs., 2017); enrofloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin và neomycin (Hazarika & cs., 2020). Do vậy, việc nghiên cứu bệnh bại huyết trên vịt và xác định khả năng vi khuẩn mẫn cảm với một số loại kháng sinh là cần thiết và cấp bách trong bối cảnh chăn nuôi hiện nay, nhất là vùng đồng bằng sông Hồng, trong đó có huyện Nam Trực, tỉnh Nam Định.

Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) được sử dụng để sàng lọc mẫu và giám định khuẩn lạc nghi ngờ với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR có độ dài 546 bp (Kardos & cs., 2007). Phân lập, xác định một số đặc tính sinh học và hình thái của vi khuẩn theo mô tả của Soman & cs. (2014). Phương pháp kháng sinh đồ sử dụng các khoanh giấy tẩm kháng sinh đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh gồm: Amox-Colis (10:10 µg); Ceptiofur (30 µg); Cefotaxime (30 µg); Ceftriaxone (30 µg); Flofenicol (30 µg); Doxycyclin (30 µg); Tetracycline (30 µg); Ampicillin (10 µg); Penicillin (100/3 µg); Sulphamethaxazole/Trimethoprime (23,75:1,25 µg). Đánh giá sự đề kháng của vi khuẩn R.anatipestifer đối với 10 loại kháng sinh được thực hiện dựa trên phương pháp khuếch tán trên thạch theo mổ tả của Bauer & cs. (1966). Đọc kết quả đường kính vòng vô khuẩn dựa trên tiêu chuẩn của viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm (CLSI., 2015). Số liệu thô được thu thập, xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2016. Số liệu được xử lý thống kê bằng phương pháp ꭓ², sử dụng phần mềm Minitab 16.0, độ tin cậy 95% (P <0,05).

Kết quả phân lập 90 mẫu bệnh phẩm thu thập được tại thực địa theo các nhóm tuổi khác nhau cho thấy: có 45 mẫu cho khuẩn lạc nghi ngờ; trong đó nhóm vịt từ 1 đến 3 tuần chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 53,57%); tiếp đến là nhóm vịt từ 3-4 tuần tuổi chiếm khoảng 50,00%; vịt trên 4 tuần tuổi có tỷ lệ dương tính thâp nhất, chiếm khoảng 43,75%. Tuy nhiên, sự sai khác trên không có ý nghĩa thống kê (P >0,05). Theo Sandhu (2008) vịt từ 1 đến 8 tuần tuổi rất mẫn cảm với mầm bệnh; vịt dưới 5 tuần tuổi thường chết trong vòng 1 đến 2 tuần sau khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng.

Trên môi trường thạch máu, vi khuẩn phát triển hình thành khuẩn lạc màu xám, lồi, hơi ướt, không gây dung huyết. Vi khuẩn R.anatipestifer không phát triển trên môi trường thạch MacConkey (hình 1). Theo Soman & cs. (2014), khi khuẩn không gây dung huyết thạch máu, hình thành khuẩn lạc màu xám, hơi ướt, trong suốt. Vi khuẩn không phát triển trên môi trường thạch MacConkey.

Hình 1. Kết quả phân lập vi khuẩn R.anatipestifer

A) Vi khuẩn R.anatipestifer phát triển trên môi trường thạch máu; B) Vi khuẩn R.anatipestifer không phát triển trên môi trường thạch MacConkey

Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa của các khuẩn lạc nghi ngờ cho thấy: có 35 trong tổng số 45 gốc khuẩn lạc mang đầy đủ các đặc tính sinh học đặc trưng cho chủng, giống như: phản ứng catalase, oxidase, urê dương tính; phản ứng idole âm tính; vi khuẩn không có khả năng di động, không có khả năng lên men đường glucose, lactose, sucrose và mannitol. R.anatipestifer là vi khuẩn gram âm, bắt màu hồng, đa hình thái (hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, trực khuẩn ngắn, thường đứng riêng lẻ hoặc từng cặp). Báo cáo của một số tác giả trước đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn R.anatipestifer không có khả năng lên men carbonhydrate; tuy nhiên, trong môi trường đệm nhóm tác giả đã phát hiện thấy lượng axít được sản sinh (Hinz & cs., 1998a). Vi khuẩn có khả năng hóa lỏng gelatin, phản ứng indol âm tính và không sinh H2S, nhưng một số chủng lại cho phản ứng indol dương tính (Hinz & cs., 1998b). Kết quả của nghiên cứu cũng phù hợp với báo cáo của Soman & cs. (20214). Như vậy, trong nghiên cứu này nhóm nghiên cứu đã phân lập được 35 chủng vi khuẩn R.anatipestifer mang đầy đủ đặc tính đặc trưng cho chủng, giống và được khẳng định bằng kỹ thuật PCR với sản phẩm có độ dài 546 bp (hình 2).

Hình 2. Kết quả giám định vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR

Giếng 1: DNA marker 100 bp; Giếng 2: Đối chứng dương; Giếng 3: Đối chứng âm; Giếng 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12: các mẫu chẩn đoán

Đánh giá khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn phân lập được với một số kháng sinh cho thấy: các chủng vi khuẩn R.anatipestifer mẫn cảm cao amox-colis (33/35 chủng). Tiếp đến, vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh ceptiofur, ceftriaxone và cefotaxime với tỷ lệ tương ứng là 91,43; 88,57 và 85,71%. Tuy nhiên, vi khuẩn lại đề kháng cao với Sulphamethaxazole/Trimethoprime. Ngoài ra, vi khuẩn cũng đề kháng với kháng sinh penicillin và ampicillin với tỷ lệ lần lượt là 14,29 và 22,86% (Hình 3). Theo báo cáo của Soman & cs. (2014), vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh ciprofloxacin, enrofloxacin và gentamycin; tuy nhiên vi khuẩn lại đề kháng với chloramphenol, amoxicillin. Năm 2016, trong báo cáo của Surya & cs. đã chỉ ra rằng vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh ciprofloxacin, enrofloxacin, gentamycin, cefuroxime. Một nghiên cứu khác cho rằng, vi khuẩn mẫn cảm cao với amoxicilline/clavulanic acid, cefotaxime, cefuroxime nhưng đề kháng cao với colistin (Chang & cs., 2019). Tại Việt Nam, theo báo cáo của Lý Thị Liên Khai và Nguyễn Hiền Hậu (2018), vi khuẩn mẫn cảm cao với tetracycline, doxycycline, flofenicol, ceftiofur và cefotaxime; tuy nhiên, vi khuẩn lại đề kháng cao với spectinomycin và sufamethoxazole/trimethoprim.

Hình 3. Kết quả đánh giá khả năng mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh

Bt: Sulphamethaxazole/Trimethoprime; AxCo: Amox-Colis; Pn: Penicillin; Eft: Ceptiofur; Cx: Ceftriaxone; Am: Ampicillin; Te: Tetracycline.

ThS. Lê Văn Hùng- Khoa Thú y

Ban Khoa học và Công nghệ