Đánh giá đặc điểm chủng vi khuẩn tiềm năng phân giải Cellulose phân lập từ phụ phẩm chế biến gỗ

Chuyển đổi sinh khối có chứa cellulose bằng các phương pháp của công nghệ sinh học là hướng ứng dụng bền vững để tạo ra các phân tử đường glucose cung cấp nguồn nguyên liệu tạo ra cồn sinh học và các nhiên liệu sinh học khác.

Các enzyme có thể phân hủy vật liệu chứa cellulose hiện nay được xem là chất xúc tác sinh học quan trọng trong các ứng dụng chuyển đổi công nghệ sinh học. Những enzyme này được tạo ra bởi nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất chứa cellulose. Các phức hợp enzyme đó bao gồm endoglucanase, exoglucanase và α -glucosidases, chúng hoạt động cùng nhau để phá hủy liên kết α-1,4 glycosidic của cellolose. Hầu hết các enzyme này được tổng hợp trong tự nhiên bởi các loài nấm như Tricoderma, Aspergillus hay từ các loài vi khuẩn như Bacillus, Clostridium và Cellulomonas. Các enzyme phân hủy cellulose tạo ra bởi vi khuẩn được đánh giá có hiệu quả xúc tác cao, các chu kỳ lên men diễn ra ngắn, sử dụng nguyên liệu rẻ tiền và dễ dàng tác động để biến đổi về mặt di truyền. Tuy nhiên, ngành công nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học hoặc các quá trình xử lý phế phụ phẩm của sản xuất nông nghiệp, công nghiệp vẫn đang cần các nguồn gen vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose cao, dễ dàng áp dụng cho chi phí thấp.

Các nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn có khả năng tăng sinh khối nhanh hơn các loài vi sinh vật và đây là nguồn cung cấp gen tiềm năng để thu nhận các sản phẩm enzyme phân hủy cellulose. Quá trình nhân sinh khối thu nhận các sản phẩm thường được kiểm soát chặt chẽ để đạt được hiệu quả cao nhất. Sản lượng enzyme cellulase thường chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như lượng chủng giống, điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ, chất hoạt hóa, chất đệm, chế độ khuấy, thời gian sinh trưởng). Chính vì lý do đó, nhóm tác giả đã thực hiện việc phân lập, nghiên cứu đặc điểm của chủng vi khuẩn thể hiện khả năng phân giải cellulose cao nhằm định hướng tìm ra các biện pháp xử lý phụ phẩm nông nghiệp chứa cellulose.

Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân giải CMC: Từ mẫu phụ phẩm chế biến gỗ được thu tại hai tỉnh Hưng Yên và Hà Nội, bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa 1% CMC (Carboxymethyl cellulose), 23 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải CMC được phân lập và trong đó, vi khuẩn C4 và C21 là hai chủng có thể hiện khả năng phân giải CMC cao. Hai chủng C4 và C21 là trực khuẩn, gram dương. Cả hai chủng đều dương tính với phản ứng MR và VP, có khả năng sinh enzyme protease, amylase và catalase ngoại bào, cũng như khả năng sử dụng nitrate là nguồn carbon cho sự sinh trưởng. Dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, cũng như đặc điểm hóa sinh cho thấy cả hai chủng vi khuẩn này đều thuộc chi Bacillus sp.

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn đến hoạt độ enzyme cellulase: Chủng C4 sau 48 giờ nuôi cấy cho hoạt độ enzyme cellulase tối đa đạt 0,373 U/ml và khi kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm hoạt độ của enzyme cellulase (Hình 1). Ngược lại, đối với chủng C21, thời gian nuôi cấy thích hợp để chủng vi khuẩn này tổng hợp cellulase với hoạt độ cao là 72 giờ đạt 1,190 U/ml. Khi tăng thời gian nuôi cấy chủng C21 lên 96h, hoạt độ enzyme giảm mạnh.

Hình 1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme cellulase của chủng tiềm năng C4 và C21

Nghiên cứu về ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh cellulase của các chủng vi khuẩn tuyển chọn cho thấy giá trị pH có ảnh hưởng khá lớn (Hình 2). Mỗi chủng thể hiện khả năng phân giải CMC hiệu quả ở môi trường có giá trị pH khác nhau. Cụ thể, hoạt độ cellulase của chủng C4 đạt cao nhất là 0,535 U/ml khi được nuôi trong môi trường LB với pH = 8. Chủng C21 được nuôi trong môi trường với pH = 6 có hoạt độ cellulase tương ứng là 1,713 U/ml. Có thể thấy đây là một ưu điểm khi ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong việc xử lý các phế phụ phẩm chứa cellulose.

Hình 2. Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến hoạt độ enzyme cellulase của chủng tiềm năng C4 và C21

Hình 3. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt độ enzyme cellulase của chủng tiềm năng C4 và C21

Ghi chú: Các công thức có ký hiệu * khác nhau là sai khác nhau có ý nghĩa thống kê với p <0.05

Trong nghiên cứu này, chủng C4 và C21 được nuôi tại các điều kiện nhiệt độ khác nhau (25°C, 30°C, 35°C, 40°C). Kết quả cho thấy, cả hai chủng C4, C21 đều thể hiện khả năng phân giải CMC khi được nuôi ở 30-40°C và hoạt tính cellulase của cả hai chủng vi khuẩn này đều đạt giá trị cao nhất ở nhiệt độ 35°C (Hình 3).

Ở thí nghiệm này, nhóm tác giả tiếp tục kế thừa kết quả nghiên cứu trên cho hai chủng tiềm năng C4 và C21 để tiến hành xác định ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (lỏng, tĩnh hoặc lỏng, lắc 180 vòng/phút). Chủng vi khuẩn C4 sẽ được nuôi cấy trong thời gian 48 giờ, pH môi trường là 8. Bên cạnh đó, chủng C21 sẽ được nuôi cấy đánh giá trong 72 giờ, pH môi trường là 6. Cả hai chủng đều được nuôi cấy ở nhiệt độ là 35°C. So sánh hai điều kiện nuôi lỏng tĩnh và lỏng lắc cho thấy khi nuôi cấy lỏng lắc cả hai chủng C4 và C21 cho hoạt độ cellulase cao hơn (Hình 4).

Hình 4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ enzyme cellulase của chủng tiềm năng C4 và C21

Ghi chú: Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện pH và nhiệt độ tối ưu trong thời gian tối ưu cho hoạt độ cellulase cao nhất.

Khả năng phân giải rơm và mùn gỗ của chủng vi khuẩn trong điều kiện in vitro: Để đánh giá được chính xác khả năng phân giải cellulose của chủng tiềm năng C4 và C21, nhóm tác giả tiến hành thử nghiệm khả năng phân giải của hai chủng trên nguồn vật liệu có nguồn gốc tự nhiên là rơm khô và mùn gỗ trong điều kiện in vitro. Kết quả cho thấy, cả hai chủng C4 và C21 đều có cho thấy khả năng phân giải vật liệu nghiên cứu với hiệu suất phân giải lần lượt là 29% và 32% đối với rơm và 28,4% và 31,2% đối với mùn gỗ. Bên cạnh đó, để đánh giá chính xác khả năng phân giải của các chủng vi khuẩn này, chúng tôi cũng xác định và so sánh với khả năng phân hủy tự nhiên ở công thức đối chứng mà các vật liệu được bổ sung vào môi trường LB không chứa vi khuẩn và số liệu được ghi nhận đã chỉ ra rằng, hai chủng tiềm năng này đều phân giải rơm và mùn gỗ cao hơn gấp 3-4 lần (Bảng 1). Cụ thể, chủng C4 phân giải rơm khô và mùn gỗ tăng 3,02-3,91 lần so với đối chứng. Trong khi đó, chủng C21 có khả năng phân giải tăng hơn so với đối chứng lần lượt là 3,33 và 4,33 lần. Như vậy, trong điều kiện in vitro, chủng C21 thể hiện khả năng phân giải rơm và mùn gỗ cao hơn chủng C4.

Bảng 1. Khả năng phân giải vật liệu có chứa cellulose của các chủng tiềm năng (sau 10 ngày xử lý ở điều kiện tối ưu)

KẾT LUẬN

Từ các mẫu phụ phẩm sau chế biến gỗ thu được tại tỉnh Hưng Yên và Hà Nội, đã tuyển chọn được chủng C4 và C21 có hoạt tính cellulase phân giải CMC cao nhất. Dựa vào các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào và các đặc điểm hóa sinh, có thể tạm kết luận chủng G4 và chủng G21 thuộc chi Bacillus sp. Chủng C4 và C21 tổng hợp cellulase có hoạt độ cao nhất ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau. Chủng C4 nuôi trong môi trường LB lỏng, điều kiện lắc 180 vòng/phút, ở 35°C, pH = 8,0 trong 48 giờ tổng hợp enzyme cellulase có hoạt độ cao nhất đạt 0,747 U/ml. Trong khi đó chủng C21 nuôi trong môi trường LB lỏng, điều kiện lắc 180 vòng/phút, ở 35°C, pH = 6,0 trong 72 giờ tổng hợp enzyme cellulase có hoạt độ cao nhất đạt 2,052 U/ml. Cả hai chủng đều thể hiện khả năng phân giải rơm và mùn gỗ trong điều kiện in vitro gấp 3,02-4,33 lần so với đối chứng. Như vậy, các kết quả nghiên cứu đạt được cho thấy, hai chủng C4 và C21 phân lập được là các chủng tiềm năng, đây sẽ là nguồn vật liệu có giá trị cho hướng nghiên cứu sử dụng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose trong xử lý phụ phẩm sau chế biến gỗ.

Khoa Công nghệ sinh học